关税大战按下暂停键，流式er惊魂未定，美国产试剂涨价预警，流式实验如何降本增效？
Bio X Cell（国内一级授权代理商生物）以其高品质的体内功能级抗体享誉全球，鲜为人知的是B家还有不少在体外实验中应用广泛的隐藏好物，今天我们就来聊聊用于Fc受体阻断的抗小鼠CD16/CD32抗体。
为什么要阻断Fc受体
抗体的结构是一个 Y 型，由高度可变的抗原结合片段（Fab段，fragment antigen-binding）和可结晶片段（Fc段，fragment crystallizable）组成，前者负责识别和结合抗原，后者通过结合Fc受体（FcR）介导其他免疫途径的效应功能，比如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和吞噬作用，抗原提呈，以及趋化因子和细胞因子的分泌[1,2]。
而在基于抗原-抗体反应的细胞分析比如流式实验中，Fc受体与抗体Fc段的结合却会成为干扰因素，产生抗原检测的假阳性信号。Fc受体阻断就是在检测抗体孵育之前先封闭掉Fc受体。
图1 抗体结构示意
Fc受体的表达与分类
抗体的恒定区决定了抗体的同种型，Fc受体根据所结合的抗体同种型分类，以日常实验和临床药物研发中使用最多的IgG为例，其Fc受体称为FcγR。人和小鼠有三个FcγR亚家族，包括高亲和力、能够结合单体IgG的FcγRI（CD64），低亲和力、主要结合抗原-抗体免疫复合物（IC IgG）的FcγRII（CD32）和FcγRIII（CD16）。此外，小鼠还有独特的高亲和力 FcγRIV（CD16.2）[2]。
大部分免疫细胞尤其是髓系细胞表达FcγR，比如在小鼠中，巨噬细胞和单核细胞高表达几乎所有类型FcγR，树突状细胞也表达多种FcγR，中性粒细胞表达FcγRIV（CD16.2）和FcγRIII（CD16），B细胞主要表达FcγRII（CD32），NK细胞表达FcγRIII（CD16） [2,3]。
图2 小鼠FcγR的表达模式及与小鼠IgG1、IgG2a/c和IgG2b的亲和力[2]
什么时候要做Fc受体阻断
研究高表达Fc受体的细胞类型，比如单核细胞和巨噬细胞，必须要做Fc受体阻断。Andersen等人详细测定了流式实验中的Fc受体结合，发现人外周血单个核细胞和单核来源巨噬细胞与小鼠IgG1和IgG2a有很强的非特异结合，而商业化Fc 阻断剂、小鼠或人血清，或是高浓度的小鼠或人IgG都能消除这种非特异信号[4]。
如果关注的不是免疫细胞，比如肿瘤细胞，当样本可能富含免疫细胞，像是实体肿瘤的细胞悬液，仍然需要避免肿瘤浸润白细胞的影响。一般来讲，实体组织来源的原代细胞在做流式实验时都需要进行Fc受体阻断。另外，对于表达水平较低的指标，或是较为稀有的细胞，Fc受体阻断能够降低噪音，提高灵敏度。
图3 人外周血单个核细胞使用不同Fc受体阻断试剂时不同同型对照的中位荧光强度[4]
然而并非所有流式实验都需要进行Fc受体阻断。明确的不表达Fc受体的细胞系，或是高纯度的不表达Fc受体的细胞，比如肿瘤细胞、上皮细胞、T细胞，没有抗体结合Fc受体的风险。而使用Fc段突变改造消除Fc受体结合能力的重组抗体能够从根源上避免这类假阳性信号。
Bio X Cell隐藏好物，抗小鼠CD16/CD32抗体
大家可能从前面的参考文献已经发现了，多种试剂都能阻断Fc受体。其中商品化的Fc受体阻断剂多为纯化的Fc受体的抗体，比如常见的小鼠Fc受体阻断剂就是小鼠CD16/CD32的抗体，比血清的批间一致性更高，比所有IgG混合物的特异性更强。这里我们推荐B家抗小鼠CD16/CD32抗体，助您实验降本增效：
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信息透明：成分、克隆和浓度信息一应俱全，InVivoMAb anti-mouse CD16/CD32（#BE0307）克隆2.4G2，同种型为大鼠IgG2b，与小鼠 CD16和 CD32的共有表位特异性反应，还有报道能非特异结合 FcγRI。注意如果在免疫检测中需要使用二抗，不能用抗大鼠 IgG2b抗体。
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充分验证：克隆2.4G2的分离与鉴定最早发表于1979年[5]，现在是最常用的小鼠Fc受体阻断剂克隆之一。根据CiteAb网站统计，#BE0307的引用文献已达280篇，覆盖流式、免疫荧光、磁珠分选和功能实验等诸多应用。
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广泛适用：#BE0307属于InVivoMAb系列，高纯度（>95%），低内毒素（<2EU/mg），尤其适合后续功能实验，甚至可以用于体内阻断。Bio X Cell还提供内毒素低于1EU/mg的InVivoPlus版本（#BP0307）。
文献案例
Arlauckas等人[6]为了探究为何有时肿瘤不响应PD-1单抗治疗，利用体内荧光显微成像追踪PD-1单抗在肿瘤微环境中的动态，发现抗体药在给药后几分钟内即有效结合瘤浸润的PD-1⁺ CD8⁺ T细胞，但是随后从T细胞表面被肿瘤相关巨噬细胞（TAM）“抢夺”并内吞，限制了药物的持续作用。随后应用抗小鼠CD16/CD32抗体进行体内外实验，证实TAM对PD-1抗体的“抢夺”依赖于Fc-FcγR的互作。
o 体外共培养实验：将荧光标记的PD-1抗体与T细胞预孵育，再与骨髓来源巨噬细胞共培养，在体系中加入抗体阻断FcγRII/III，能够显著减少PD-1抗体荧光从T细胞向巨噬细胞的转移。
o 小鼠体内实验：在PD-1单抗给药前连续5天每天腹腔注射200μg小鼠CD16/CD32抗体，阻断外周巨噬细胞上的FcγRII/III，显著延长PD-1单抗与肿瘤浸润CD8⁺ T细胞的结合时长，并且彻底消除了不响应者，联合给药在所有小鼠中实现肿瘤消除。
图4 体外共培养实验证实PD-1抗体从T细胞表面向巨噬细胞的转移由FcγRII/III介导
图5 体内阻断FcγR在MC38小鼠模型中延长PD-1单抗与T细胞的结合时长，提高治疗效果
最后悄悄说，抗小鼠CD16/CD32抗体延续了B家体内抗体传统，相同克隆按实际抗体含量计算，性价比超高，很多机智的大牛实验室已经用来发顶刊啦。如果您想了解这一抗体的更多应用案例、使用方法和购买信息，欢迎联系我们或咨询我们在中国的一级授权代理商欣博盛生物。
参考文献
1. Nimmerjahn, F, Ravetch, JV (2008) Fcγ receptors as regulators of immune responses. Nat Rev Immunol. 8(1):34-47. doi: 10.1038/nri2206.
2. Galvez-Cancino, F, et al (2024) Fcγ receptors and immunomodulatory antibodies in cancer. Nat Rev Cancer. 24(1):51-71. doi: 10.1038/s41568-023-00637-8.
3. Guilliams, M, et al (2014) The function of Fcγ receptors in dendritic cells and macrophages. Nat Rev Immunol. 14(2):94-108. doi: 10.1038/nri3582.
4. Andersen, MN, et al (2016) Elimination of erroneous results in flow cytometry caused by antibody binding to Fc receptors on human monocytes and macrophages. Cytometry A. 89(11):1001-1009. doi: 10.1002/cyto.a.22995.
5. Unkeless, JC (1979) Characterization of a monoclonal antibody directed against mouse macrophage and lymphocyte Fc receptors. J Exp Med. 150(3):580-596. doi: 10.1084/jem.150.3.580.
6. Arlauckas, SP, et al (2017) In vivo imaging reveals a tumor-associated macrophage-mediated resistance pathway in anti-PD-1 therapy. Sci Transl Med. 9(389):eaal3604. doi: 10.1126/scitranslmed.aal3604.
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